細胞培養小室/ 培養板的介紹與經典應用
來源：暫無 瀏覽量：載入中...發布時間：2023.03.29
插入式細胞培養小室和嵌套式培養板
從1950年代開始，默克密理博的較高質量膜就被科學家創新地應用于細胞培養實驗并發表了眾多高水平的研究報告。經過幾十年的實踐和優化，Millicell®系列產品已經成為細胞相關研究的基本工具。
接近天然狀態的細胞生長
Millicell®插入式細胞培養小室和培養板底面為膜材質，使生長的細胞上下兩側都易于被接觸。因此細胞處于3D生長狀態，比塑料表面更能模擬細胞在生物體內的情況。而且，Millicell®插入式細胞培養小室使細胞共培養及對單層細胞的上下兩面進行研究變得非常方便。
產品優點
· 改善細胞形態結構
· 更完善的細胞分化
· 更多的細胞器
· 更高的細胞密度
品種齊全，方便選擇
既提供懸掛式和站立式的單孔插入式細胞培養小室，也有24孔和96孔的插入式細胞培養板及套件，還有經組織培養處理的接收板；以上每種產品又包括不同膜材質和膜孔徑的多種選擇。此外默克密理博還比較廣提供細胞培養中必需的純水制備系統、無菌過濾裝置、細胞計數器、培養基及各種添加劑、***、細胞遷移研究等完整試劑盒。關于細胞培養與檢測的各類技術問題，默克密理博富有經驗的專家團隊也隨時給予您專業的幫助。
插入式培養小室為單個無菌包裝形式，方便好用，減少浪費
Millicell® 懸掛式細胞培養小室
· 用于細胞共培養、滲透性試驗及頻繁的不依賴操作
· 獨特的設計使上下兩側操作都非常方便，減少對細胞的損害和污染
· 全部為PET膜材質，有5種膜孔徑和3種膜面積（適合不同多孔板）的產品供選擇；其中1μm孔徑的是透明的，特別推薦用于光學觀察
Millicell® 站立式細胞培養小室
· 細胞生長狀態比較好，多種選擇使各種細胞學研究極為方便
· 膜材質包括Biopore?(PTFE)膜，MF-Millipore?（混合纖維素酯）膜，聚碳酸酯膜等，有5種膜孔徑、2種膜面積供選擇（適合6孔板和24孔板）
Millicell® **培養型站立式培養小室
· 獲得活性更高的培養細胞和組織，特別推薦用于體外移植物的立體培養和長期組織結構研究
· 較薄且更低的側壁，使其更好地適合標準培養皿尺寸，操作也更方便
· Biopore?（PTFE）膜透氧性及透光性也非常出色，有助于提高細胞的存活力，最長超過40天
膜的類型及其特點
透氧透光性好，3D組織培養和觀察**
膜厚50μm，*0.4μm一種規格，需包被ECM。透明性很好，熒光背景低，蛋白吸附低，適合細胞顯微觀察。透氧性好，最適合用于組織**的長時間培養和觀察。有站立式和**培養型Millicell®產品形式。
Isopore? PCF 膜(聚碳酸酯)
規格齊全，特別適合轉運和滲透性等研究
10μm薄膜，膜孔徑齊全。已經組織培養預處理，不需包被ECM。低熒光背景，低蛋白吸附，*有站立式Millicell®產品形式。
MF-Millipore?MCE膜(混合纖維素酯)，HA
文獻引用率高，用于毒理和極化等研究
120μm厚不含Triton®的混合纖維素酯膜，*0.45μm一種規格，不需包被ECM。用于細胞表面受體、體外毒理學、微生物吸附和極化吸收分析。與塑料培養皿相比，細胞在此膜上生長密度可提高2到3倍，而且具有更好的細胞形態。*有站立式Millicell®產品形式。
Isopore? PCF 膜(聚碳酸酯)
規格齊全，特別適合轉運和滲透性等研究
10μm薄膜，膜孔徑齊全。已經組織培養預處理，不需包被ECM。低熒光背景，低蛋白吸附，*有站立式Millicell®產品形式。
PET 膜(聚乙烯對苯二酸酯)
功能比較廣，是懸掛式Millicell®**采用的膜材質
10μm超薄蝕刻膜，其中孔徑為1μm規格的透明性比較好，可用于直接觀察。低熒光背景，低蛋白吸附，孔徑齊全，不需要ECM細胞即能生長良好。是懸掛式Millicell小室的**用膜。
規格
Millicell®細胞培養小室/培養板的經典應用
實驗目的：研究**細胞侵襲能力
實驗簡介：
**細胞侵襲能力檢測在**學（遷移、侵襲）和免疫學（遷移、趨化）中是常規實驗。
1.侵襲是細胞遷移的一種。細胞遷移分三種類型：趨觸、趨化和侵襲。趨觸是指細胞定向向一些整聯蛋白或粘附蛋白受體遷移的能力，例如上皮細胞和成纖維細胞；趨化指細胞趨向于一些化學分子的特性，例如免疫細胞；侵襲通常指**細胞分泌因子降解并穿透基質膠的能力。
2.**細胞的侵襲性是**相關信號通路、藥物**、靶向**、致 / 抑基因等**學研究的一個重要指標。
3.免疫細胞具有趨化性，例如粒細胞、巨噬細胞、單核細胞對CCL、CXCL 類因子的趨化性，免疫細胞異常（如過度趨化）通常會引起一些炎癥類疾病如風濕、關節炎、牛皮蘚、動脈粥樣化等。
常見檢測細胞：
**細胞（MDA-MB-231, MCF-7, HT1080, B16F10）等，用孔徑為 8μm 的培養小室。
巨噬細胞、單核細胞 PMN：用孔徑為 5μm 的培養小室。
內皮細胞（HUVEC）、白血病細胞K562、骨髓瘤細胞HB124：用孔徑為 3μm 或 5μm 的培養小室。
具體操作：
以配合24孔板的8μm PET膜Millicell®懸掛式細胞培養小室（cat#MCEP24H48）為例，
實驗周期：3-5天
1. 復蘇代數靠前的**細胞，在含有10%FBS的培養基中預先培養2-3代，待細胞匯合達到80%左右，饑餓處理18-24小時。
2. 準備鋪膠：
a）4 °C融EMC膠過夜。
b）將細胞小室、培養板和只有頭等于4°C 預冷。
c）用無血清的冷培養基稀釋ECM膠至20μg/mL，以5-10μg/cm2的密度加入到細胞小室的上層（按照ECM產品說明書的推薦比例和體積），輕輕搖晃使膠均勻鋪在膜上。以上操作在冰上進行。
d）立即將鋪好ECM膠的細胞小室置于培養板中，于37°C孵育1小時，ECM膠可由液體凝成固體，吸走多余的或者未凝的膠。
3. 細胞用PBS清洗一次，EDTA或者0.05%胰酶消化，然后用包含5%BSA的無血清培養基中和，1500rpm離心5-10min。
4. 用無血清培養基重懸細胞，調整細胞密度至0.5-2.0x106cell/ml。
5. 取上述200μL細胞液加入小室，下室（培養板）
加入900L含有10% FBS的培養基。不同規格的
小室和培養板所加的體積不同，具體參考
Millicell®產品說明書。
6. 37°C孵育24至72小時，依據**細胞類型而定。
7. 孵育結束，小心取出細胞小室，吸掉小室上層培養液，PBS清洗一遍，70%酒精或者4%多聚甲醛固定5min，0.5%結晶紫（2%乙醇或PBS溶解）染色20min，然后進行第8步或者第9步。
8. PBS清洗兩次以去除多余的染料，立即用棉簽擦去濾膜上層的細胞，自然靜置風干。顯微鏡下觀察濾膜下層的細胞，隨機選取不同的視野計數并算平均值。
9. 結晶紫溶解濾膜下層細胞，然后用33%醋酸脫色，將結晶紫完全洗脫下來，洗脫液可在酶標儀上570nm讀取OD值。這種方法可以避免視野下細胞穿透不均勻帶來的誤差。
本實驗技術要點：
1. **細胞比較好經過饑餓處理，并且小室上下培養基的FBS有濃度差，以保證細胞可以穿透基質膠。
2. 鋪細胞要均勻，濾膜底部不能產生氣泡，否則會導致細胞染色不均勻，或者局部細胞無法穿透。
3. 根據細胞類型選擇合適的膜孔徑和膜類型。PET膜兼容**，適合絕大多數種類的細胞。
4. 侵襲實驗的細胞密度比較大，一般在 10(6)cells/cm2左右，不同**細胞的接種密度、培養時間不同，需要參考文獻和實驗摸索。細胞太少，遷移不過去；細胞太多，可能導致正常組和實驗組無差異。
5. **做實驗需要用正常的細胞摸索合適的細胞密度和培養時間，確定之后再加實驗組，同時如果條件允許，設置一組已知高遷移性的細胞作陽性對照。
6. 注意細胞小室內外培養基的比例，不要使小室外培養基超過小室內培養基液面。
7. 觀察細胞時一定要擦去小室內部貼在膜上的細胞。
藥物跨內皮細胞滲透性實驗
實驗目的：研究某種藥物分子穿透內皮細胞的滲透率
實驗簡介：
藥物研究包括吸收、分配、代謝、排泄和毒性等多個方面，而吸收是第一步。這個實驗在以內皮細胞通透性、藥物滲透等為研究方向的課題中很常用。
常見檢測細胞：人結腸腺細胞系 Caco-2、HT-29、Lovo、SW-480，人結腸上皮細胞 T84，狗腎上皮細胞系 MDCK，豬腎上皮細胞系LLC/PK1 等，主要模型為上皮細胞吸收、血腦屏障。
具體操作：
1. 上皮細胞生長到細胞匯合度達80-90%時開始實驗，不要超過90%，否則會影響到后續細胞單層的形成。
2. 將細胞均勻接種在小室膜上。對于24孔板和96孔板的接種密度見本文圖示。
3. 每隔2天用電阻儀測量細胞跨膜電阻值，直到達到平臺，提示細胞已經形成致密單層；或者通過檢測熒光染料熒光黃的通過率，以判斷細胞剛好完全匯合。電阻儀測量因不傷害細胞，可以繼續培養而比熒光黃法更為普遍地被采用。
4. 細胞單層匯合后，用DPBS清洗一次細胞，加入含有不同濃度藥物（一般10-200μM）的緩沖液。如果要測藥物從上至下的運輸效果，則上層小室中加藥物，下層培養板孔里只加緩沖液；反之則相反。
5. 將培養板在37℃條件下培養（60rpm震蕩或者不震蕩）1-2h，到達時間之后，分別從細胞小室和培養孔里取出一定體積緩沖液（一般50μL ）轉移至新的轉運分析板進行LC/MC分析。對于放射性標記藥物，分別取出20μL緩沖液加入100μL閃爍液，通過多孔閃爍讀板儀讀值。
藥物轉運計算：
藥物滲透率以每秒多少厘米為單位，即視 滲透率apparent permeability: VA是接收孔里的體積（mL）；Area是膜表面積（cm2）；time 是整個滲透時間（s）。如果使用閃爍讀板儀，可以將 CPM 值直接替代 [drug]。
Caco-2細胞分化對跨內皮細胞電阻值的影響
Caco-2細胞在細胞小室上培養15天，每隔3天測量電阻值（未分化），直到第15天（完全分化）。每個時間點設置6個復孔。James C. Fleet, and Richard J. Wood Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 1999;276:G958-G964..
本實驗技術要點：
1. 細胞密度對于Caco-2細胞的生長和分化很重要，最初實驗時可以設置幾個梯度以確定**細胞密度，例如：10-day Caco-2 Cell Seeding Density 可以設置為10,000至35,000細胞/孔；21-day Caco-2 Cell Seeding Density可設為從6,000至12,500細胞/孔。
2. 換液時不要碰到或者吹散細胞，盡可能避免破壞細胞單層。Millipore Caco-2 96 孔培養板的淚滴狀設計可以使操作者換液時不必拆開小室與培養板套件，從而避免這一情況。
3. Caco-2 細胞形成細胞單層時會在細胞表面分泌P-糖蛋白，是分化的標志物。有些化合物可以和P-糖蛋白反應而抑制向下滲透，因而從上至下和從下至上的滲透比例有所不同。
細胞共培養
實驗目的：研究兩種或三種細胞之間的相互作用
實驗簡介：
共培養是通過分別在小室內外培養兩種或以上細胞，來研究細胞之間的相互作用，例如不同CD亞型的免疫細胞、免疫細胞和**細胞、飼養層和干細胞等。因此，在免疫、**、干細胞等領域都有**應用。
具體操作：
細胞共培養分為兩個類型：一種是在膜的上下側分別培養兩種細胞，一種是在小室和培養板孔里分別培養細胞。前一種用站立式較多，后一種用PET懸掛式小室更方便，不會破壞孔里的細胞。以配合24孔板的0.4μm PCF膜Millicell®站立式細胞培養小室（cat# PIHP01250）為例。
實驗周期：1-3天
方法1
1. 將小室放在24孔板里，用培養基潤濕膜。
2. 反轉小室，底面朝上，加入約200μL細胞懸液，
置于37℃細胞培養箱培養1-4小時，使細胞貼膜。
3. 輕輕將小室正立在培養板孔里，在小室里層種第二種細胞，并在小室里面和外面都加培養基，繼續培養至細胞貼膜。
4. 依照實驗目的加入各種刺激或者繼續培養細胞。
方法2
1. 將小室正放在24孔板里，先在小室里面鋪一種細胞，在細胞培養箱里面培養至細胞貼膜。
2. 反轉小室，底面朝上，置于一個新的培養皿上，鋪第二種細胞，體積稍微小一點（100-200uL），培養1-4小時使細胞貼膜。
3. 眾多再輕輕將小室正立在24孔板里，繼續培養細胞或者加入刺激。
本實驗技術要點：
1. 根據共培養的形式選擇合適的小室型號（懸掛式或者站立式），如果需要在細胞培養板上也種細
胞，則需要用PET懸掛式。
2. 反面種細胞時注意不要使培養基干掉，否則會影響細胞貼壁和存活。
3. 共培養的細胞密度不宜過多，一般10(3)cells/cm(2)左右，需要根據細胞類型和培養時間而定，建議做預實驗摸索。
推薦新聞
客服